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A partir de hoje, a proteína Catepsina B recombinante tornou-se uma ferramenta crucial no mundo da pesquisa biotecnológica. Porém, produzir essa proteína em laboratório é uma coisa, e entender seus ensaios e técnicas analíticas é completamente diferente. Sem falar que este último permite aos pesquisadores compreender a estrutura, função e potencial dessa proteína recombinante.
Este blog irá explorar as principais abordagens utilizadas em laboratório para estudar a proteína Catepsina B recombinante, desde ensaios de atividade clássicos até tecnologias analíticas de ponta.
Ensaios de atividade enzimática
O primeiro passo para caracterizar oproteína catepsina B recombinanteestá verificando se está ativo. Para fazer isso, os pesquisadores usam um teste chamado ensaio de atividade enzimática, que fornece leituras diretas da função catalítica. Os três tipos diferentes de ensaios de atividade enzimática são:
Ensaios fluorométricos:Estes são um dos ensaios mais utilizados devido à sua sensibilidade e são simples de usar. Neste, substratos especiais são projetados com um marcador fluorescente que é liberado quando a Catepsina B corta com sucesso a ligação peptídica. Este aumento na intensidade da fluorescência pode ser medido em tempo real, possibilitando o rastreamento da cinética enzimática.
Ensaios colorimétricos:Esses ensaios funcionam mais ou menos da mesma forma que os ensaios fluorométricos; entretanto, neste caso, é utilizada uma etiqueta cromogênica (amigável ao orçamento), que é menos sensível que os métodos fluorométricos.
Ensaios de atividade à base de gel:Neste, os pesquisadores incorporam o substrato da Catepsina B em uma placa semelhante a gelatina, também conhecida como gel. Em seguida, a amostra de proteína passa pelo gel, que separa as proteínas com base no seu tamanho, e quando o gel é ativado, a catepsina B ativa começa a consumir o substrato ao seu redor.
Estudos Cinéticos e de Inibição
Depois que os pesquisadores estabelecem que a proteína recombinante está ativa, eles geralmente medem parâmetros cinéticos como Km (afinidade do substrato) e Vmax (velocidade máxima), que lhes informam sobre os hábitos naturais de funcionamento da enzima. Estes valores são obtidos através da monitorização das taxas de reação em diferentes concentrações de substrato, muitas vezes utilizando ensaios fluorométricos.
Tão importantes quanto os estudos cinéticos são os estudos sobre inibidores. Estes dizem aos pesquisadores quão bem os inibidores da catepsina B, como E-64 e CA-074, podem bloquear a atividade da enzima. Estes estudos de inibidores são críticos na descoberta de medicamentos, onde a Catepsina B é considerada um alvo terapêutico no cancro, doenças inflamatórias e distúrbios neurológicos.
Técnicas Estruturais e Biofísicas
Essas técnicas são semelhantes a tirar fotografias e medições detalhadas da enzima para compreender sua forma física e como ela se move. Aqui estão quatro técnicas comumente usadas:
Cristalografia de raios X:Esta técnica permite aos pesquisadores criar uma imagem 3D detalhada de toda a enzima. Para fazer isso, os pesquisadores cultivam cristais minúsculos e perfeitos da proteína Catepsina B e disparam raios X contra eles. Ao calcular a forma como os raios X refletem no cristal, a posição exata de cada átomo é determinada.
Espectroscopia de RMN:Assim como as máquinas de ressonância magnética, a espectroscopia de RMN utiliza poderosos campos magnéticos e ondas de rádio para estudar a enzima, geralmente quando ela está dissolvida em água (em solução). Isto revela alterações estruturais na ligação do inibidor.
Espectroscopia de dicroísmo circular (CD):Esta técnica fornece aos pesquisadores informações sobre a forma interna que a enzima alcançou. É realizado calculando o padrão de absorção de luz, pois revela a porcentagem das formas básicas, ou seja, espirais (hélices α) ou folhas planas (folhas β)
Calorimetria exploratória diferencial (DSC):Para determinar a resistência e estabilidade da enzima, o DSC permite aos investigadores calcular a pequena quantidade de energia térmica absorvida pela enzima quando esta começa a desdobrar-se ou derreter.
Espectrometria de Massa e Proteômica
Outra abordagem poderosa é a espectrometria de massa (MS). A catepsina B recombinante pode ser analisada de duas maneiras principais:
Caracterização de proteínas:MS pode confirmar a identidade da proteína, detectar modificações pós-traducionais e garantir a pureza.
Mapeamento de substrato:Na proteômica, a MS é usada para identificar produtos de clivagem gerados quando a catepsina B digere misturas complexas de proteínas. Isso ajuda a mapear a especificidade do substrato e a compreender o papel da enzima nas vias biológicas.
Abordagens analíticas emergentes
À medida que a tecnologia avança, os investigadores estão a desenvolver formas ainda mais sofisticadas de sondar a Catepsina B recombinante.
Ressonância plasmônica de superfície (SPR):Mede interações em tempo real entre catepsina B e ligantes (substratos, inibidores ou proteínas) sem necessidade de rótulos. Isto fornece dados de ligação cinética que complementam os ensaios enzimáticos.
Docking molecular e simulações:Abordagens computacionais prevêem como os inibidores se encaixam no sítio ativo da Catepsina B, muitas vezes usando dados de cristalografia como entrada.
Microscopia de fluorescência de molécula única:Um campo emergente onde moléculas de enzimas individuais podem ser observadas em ação, oferecendo detalhes sem precedentes sobre dinâmica e variabilidade.
