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Clostridium botulinum é o tipo de bactéria neurotoxina que gera um determinado tipo de proteína que causa graves efeitos no funcionamento do sistema nervoso periférico ou central. Este artigo é sobre kits ELISA A, B, E, F de toxina botulínica para investigações laboratoriais clínicas de botulismo humano.
A bactéria Clostridium botulinum pode permanecer viva mesmo na ausência de oxigênio e é por isso que é chamada de bactéria anaeróbica. Tem a forma de uma haste e forma esporos, por isso pode resistir a produtos químicos e à pressão física. Em circunstâncias específicas, estas bactérias podem produzir toxinas através do desenvolvimento de alimentos.
A presença da bactéria Clostridium botulinum nos alimentos pode levar a graves consequências de intoxicação alimentar quando o alimento afetado por essa bactéria é consumido. No caso do surto de botulismo, os 962 registros nos EUA registrados de 1899 a 1990 incluíram 2.320 casos e a morte de 1.036 pessoas. O tipo de toxina foi determinado pelos pesquisadores que incluíram 384 casos do tipo A, 106 do tipo B, 105 do tipo E e 3 do tipo F.1 Nos outros dois surtos de botulismo houve presença de toxinas do tipo A e B. No entanto, todos os estudos realizados para a toxina botulínica do tipo F e G mostraram que ela geralmente causa a doença do botulismo em animais.
Tipos de Clostridium Botulinum
Clostridium botulinum pode ser classificado em diferentes categorias dependendo dos atributos bioquímicos, culturais e fisiológicos. As toxinas Clostridium botulinum do tipo C e tipo D possuem uma forma metabólica que as diferencia das demais e não conseguem catalisar a quebra das proteínas do ovo sólido ou da carne. A enzima proteolítica está presente em todos os tipos A e poucos dos tipos B e F do Clostridium botulinum. Todas as cepas do tipo E e as poucas que sobraram dos tipos B e F não produzem enzimas proteolíticas e possuem uma forma metabólica formada por carboidratos diferentes das classes não proteolíticas do tipo C e D. Os pesquisadores ainda não estudaram e discutiram a toxina do tipo G que é produzida por certas cepas e não pôde ser caracterizada de forma eficaz.
Kit de toxina botulínica ELISA tipo A, B, E e F para investigações laboratoriais clínicas de botulismo humano
Vamos entender a utilidade do kit ELISA de toxina botulínica tipo A, B, E e F para investigações laboratoriais clínicas de botulismo humano. Estudos recentes desenvolveram formas mais rápidas e alternativas do que os procedimentos in vitro para detectar os organismos que produzem um tipo de Clostridium botulinum e as toxinas. Com a ajuda de técnicas de ELISA, é possível detectar o tipo de toxinas geradas através dos meios de cultura.2 Essas técnicas incluem amp-ELISA e DIG-ELISA. A técnica ELISA leva um dia para detectar a toxina após ela ser deixada para o processo de incubação dos esporos da bactéria botulínica durante toda a noite. Ao detectar a toxina fetoproteína, ele pode detectar facilmente toxinas biologicamente móveis e imóveis.
Kit de toxina botulínica ELISA tipo A, B, E e F para investigações laboratoriais clínicas de botulismo humano – processo ELISA amplificado
As toxinas botulínicas do tipo A, B, E e F podem ser facilmente detectadas pelo procedimento ELISA amplificado, que tem uma limitação de aprox. 10 MLD/ml para a detecção. A cultura da presença tóxica é além disso antigénica em comparação com as toxinas refinadas e o grau de detecção no caso de ELISA amplificado é mais delicado do que o bioensaio em ratos. O TPGY, assim como o CMM, é examinado porque pode haver produção de mais toxinas em um único meio em comparação ao bioensaio em camundongos ou outros métodos de detecção necessários para a verificação da detecção de toxinas através da técnica ELISA que também utiliza meios similares.
Procedimento
Aqui está o procedimento do kit ELISA de toxina botulínica Tipo A, B, E e F para investigações laboratoriais clínicas de botulismo humano.
Preparação de Amostras
Amostras de alimentos são isoladas das placas de ágar e imunizadas em CMM e TPGY. O caldo TYGA Extract e a carne preparada atuam como meio e são cultivados a 26 graus e 35 graus Celsius de temperatura por 5 dias. O alimento é então submetido a um processo de ultracentrífuga a 7.000 x ge 4 graus Celsius por 30 minutos, o pH do sobrenadante é então modificado para 7,4 a 7,6 usando NaOH 1N ou HCL 1N. As amostras e seus controles são então examinados em uma amostra duplicada para CMM e TPGY. É feito o exame minucioso do puro e da diluição na proporção de 1:5 para cada sobrenadante cultivado.
Preparação de placas de microtitulação
Cada uma das placas de microtitulação deve ser bem revestida com a diluição perfeita da antitoxina tipo A, E ou F de cabra em 100 microlitros ou diluição de antitoxina tipo B de coelho dentro do tampão bicarbonato. A preparação de um determinado número de placas de microtitulação é necessária para o exame das amostras. Deve-se trabalhar de acordo com as instruções fornecidas e diluir a quantidade de antitoxina conforme as instruções. A placa preparada deve ser armazenada adequadamente a 4 graus Celsius e a parte superior deve ser revestida com um selo plástico para protegê-la do ressecamento.
Análise de ELISA em Meios de Cultura
- As placas devem ser lavadas e depois bloqueadas. As amostras da toxina e controles devem ser colocadas e deixadas por 2 horas para incubação.
- A placa deve então ser lavada e embebida em IgG biotinilada e deixada por 1 hora para incubação.
- A placa deve ser deixada por 1 hora de incubação após lavagem e colocação em Extravidin conjugado
- Deve ser deixado por 12,5 minutos de incubação após a lavagem e colocação no substrato Gibco e deve ser novamente deixado por 2 a 10 minutos de incubação após a colocação do amplificador Gibco.
- Por último, mas não menos importante, as placas devem ser lidas no leitor de microplacas.
Kit de Toxina Botulínica ELISA Tipo A, B, E e F para Investigações Laboratoriais Clínicas de Botulismo Humano – DIG-ELISA
O método específico de DIG-ELISA é uma versão avançada do ELISA amplificado. A IgG marcada com biotina é substituída por antitoxina marcada com digoxigenina e a estreptavidina-fosfatização alcalina é substituída por antidigoxigenina conjugada com peroxidase de rábano no caso de DIG-ELISA. O TMB é considerado um substrato exato para a enzima peroxidase de rábano e a detecção da toxina botulínica dos tipos A, B, E e F pode ser feita a 10 MLD/ml. O TPGY, assim como o CMM, é examinado, pois pode haver produção de mais toxinas em um único meio em comparação ao bioensaio em camundongos, o que também torna útil meios semelhantes. A cultura da presença tóxica é além disso antigênica em comparação com as toxinas refinadas e o grau de detecção no caso do DIG-ELISA é mais delicado do que o bioensaio em camundongos.
O Procedimento de DIG-ELISA para Detecção de Clostridium botulinum
Procedimento de preparação
Após seguir o procedimento de ultracentrífuga a porção líquida que se separou da parte sólida é utilizada para a cultura TPGY e CMM para exame da produção de toxina por DIG-ELISA. A parte líquida extraída das culturas originais de CMM e TPGY é misturada com o tampão de magnitude semelhante de fosfato de gelatina. As misturas preparadas são então coadas através de um filtro de seringa com tamanho de poro de 0,22 microlitros. Este procedimento é então acompanhado pelo método de bioensaio em camundongos.
Preparação das Placas de Microtitulação
Cada uma das placas de microtitulação deve ser bem revestida com a diluição perfeita da antitoxina tipo A, E ou F de cabra em 100 microlitros ou diluição de antitoxina tipo B de coelho dentro do tampão bicarbonato. A preparação de um determinado número de placas de microtitulação é necessária para o exame das amostras. Deve-se trabalhar de acordo com as instruções fornecidas e diluir a quantidade de antitoxina conforme as instruções. A placa preparada deve ser armazenada adequadamente a 4 graus Celsius e a parte superior deve ser revestida com um selo plástico para protegê-la do ressecamento.
Análise de amostras através de ELISA
- Após a lavagem as placas devem ser bloqueadas e em seguida as amostras juntamente com os controles devem ser colocadas e deixadas por 2 horas para incubação.
- A IgG marcada com digoxigenina deve ser colocada após a lavagem e deixada por uma hora para incubação.
- O conjugado antidigoxigenina peroxidase de rábano deve ser colocado após a lavagem e deixado por uma hora de incubação.
- São necessários 20 a 30 minutos do período de incubação após a colocação do substrato TMB quando a lavagem é feita.
- Um agente químico é necessário para interromper a reação.
- Com a ajuda de um leitor de microplacas de 450 nanômetros, a absorbância deve ser medida nas placas.
Locais onde a bactéria Clostridium botulinum é encontrada
Clostridium botulinum é difundido na camada superficial do solo e também nos depósitos presentes nos mares e lagos. Esta é a razão pela qual o Clostridium botulinum do tipo E é encontrado principalmente em animais aquáticos e peixes ou frutos do mar são frequentemente adulterados por este tipo de bactéria. As bactérias Clostridium botulinum dos tipos A e B são encontradas principalmente em produtos alimentícios obtidos do solo, que já está contaminado por tal bactéria. Nos Estados Unidos, são principalmente os vegetais enlatados que estão contaminados por essa bactéria, mas na Europa, até os produtos cárneos estão contaminados por essas bactérias e causam um sério motivo de doenças causadas pelo consumo de um determinado tipo de alimento.
Conclusão
Esta análise foi feita principalmente para compreender a utilidade do kit ELISA de toxina botulínica tipo A, B, E e F para investigações laboratoriais clínicas de botulismo humano. Anteriormente, o bioensaio em camundongos era considerado o método mais confiável para detectar as toxinas produzidas pela bactéria Clostridium botulinum, mas em estudos recentes o ELISA amplificado e o DIG-ELISA são considerados mais eficazes para encontrar as toxinas produzidas pela bactéria Clostridium Botulinum do tipo A, B, E e F. Esses métodos garantem resultados rápidos e exatos por ocasião de um surto da doença Clostridium Botulinum.
Referências:
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1471988/
- http://www.inderscience.com/info/inarticle.php?artid=41817
Leia também:
- Reações alérgicas à antitoxina botulínica
- Toxina Botulínica no Tratamento da Dor
